核酸檢測CT=40意味著什麼

才意識到中國之前的陰性標準是所謂“CT值為40”(現在好像降低到一個30多的區間)。

我……至少對此有極大的疑惑。

想必大家都知道了現在檢測一個是核酸、一個是抗體。核酸檢測使用的是基於鍊式聚合酶反應(PCR)的定量版本qPCR (quantitive PCR) 嘛哈。作為一條科研老癩皮狗，從讀研開始，作為當時實驗室第一個學習使用這個技術的人，曾經發毒誓絕對不再做要用這個技術的課題，結果直到現在，一秒鐘都沒甩脫手過，還越做越多，變成專職qPCR、人肉點板機了。

先誠請毛象上真正好好學習的學妹學弟同年學長老師師祖們多多包涵本狗在諸位尚未發聲的此刻，本科研老賴居然敢關公廟前耍大刀……請多多包涵、指正。

首先，這個CT值，它不是一個“客觀”的絕對數值。就是說，它不是像你稱一個橙子那樣，放到秤上面，給出你一個幾斤幾兩的單位。也不是像測定激素什麼的，給你說一個每毫升多少皮克、納克什麼的那樣的單位。CT是一個相對概念。它的全稱是 Cycle Threshold，循環閾值。

這個“循環”是指PCR反應完成一個“DNA雙鏈變性成單鏈-退火與引物配對-DNA合成酶開始根據DNA模板鏈合成新的精準配對的配對鏈”這樣一個通過PCR儀操控、基於溫度變化控制生化反應的這麼一個循環。通過循環往復這樣的溫度變化/生化反應循環，特定的DNA鏈就能被擴增，一變二，2-4，4-8，8-16……越來越多。如果我們在擴增DNA的原材料或反應液體裡加入標記物，比如結合DNA雙鏈就能發熒光但是單鏈不發光的染料，那麼隨著合成的DNA雙鏈的增多，反應液裡能發的光就越來越多。通過監測這個熒光變化，再根據所花費的循環數，就能建立一個可能反推出樣本裡的某個DNA序列的含量的變化關係。

然後，這個2-4-8-16-32這個倍增變化/熒光強度畫成指數圖的話(如下圖)，在前期基本不怎麼增長的區間(胡亂起個名字就叫 背景噪音區間 吧)之後，有一個線性增長的區間，就是多一個循環，就多成比例的產物。這個區間對於建立前面提到的樣本量-循環數的關係非常重要。

這個qPCR裡的“閾值”就是被人為定義的一個“a fluorescent signal significantly above the background fluorescence”，通常這個Significantly above的熒光強度是背景噪音區間強度的十倍。這個十倍就是一個人為界定的數值！！到了這個十倍，就是指數增長區間，就可以利用這個來推算相對的樣本量等等。CT就是這麼來的。你非要用5倍、50倍、100倍來定CT，沒人管你。只是大家都認可10倍就是10倍咯這樣的。所以CT的意思就是PCR反應把要檢測、你感興趣的DNA序列擴增到它所激發的熒光強度是其baseline熒光強度的十倍所需要的PCR反應循環數這麼個意思。除了PCR反應本身，這個噪音區間也是很容易受到各種條件影響而發生變化的，所以CT本身是一個非常不“客觀”的相對概念。

那麼“40”這個數字對於CT值意味著什麼呢。因為通常一個qPCR的程序設定的就是跑40個循環(!!!)。如果有足夠量的初始DNA模板在你的樣本裡，那它在這40個循環裡面就可能早早就能進入指數增長區間，所以初始DNA越多，CT值越低。所以就有了大家經常能看到的“CT越低得病越重”的說法。那麼設定陰性為40，就是要求40個循環跑到底，都測不到一定量的信號。

看起來挺合理啊……但是……作為一個做了那麼久qPCR的老狗，我想說……這個要求真的很誇張。這麼說吧，我給你打包票，你就是拿水放進qPCR儀裡面，都不保證一定全部是40，還不要說加了各種反應物在裡面發生的可能的非特異反應產生的熒光。而且事實上，在我們實驗室操作實踐裡面，因為所謂生物大分子氣溶膠什麼的實驗室環境產生的樣品污染而引起的“超純水都能跑出產物”根本不是新鮮事。我們平時實驗中，一般 CT>30 (倍增了2^30倍才被檢測到)基本都認為是等於是檢測不到的極低極低的量了(當然正規的科學表述和做結論的標準不是這樣的，而且回答的問題也不一樣)。而我平時所有實驗所有反應都會設置的陰性對照(鐵定沒有目標DNA的反應管)，被用來當內源性參照物、被全世界每個做qPCR的科學家都要拿來每一天在分散在全球各地的實驗室裡測個幾百邊的持家基因、完備得不能再完備、成熟地不能再成熟的反應體系能做出40都是要看命的！(當然說我水平差也無妨，哈哈)

所以，對qPCR在我看來是很容易出偏差的一種定量檢測，正確的做法應該是設置與反應管同時處理、使用同批試劑等等相同實驗條件的確定陽性樣本的對照管和確定陰性的陰性對照管，以樣本管和兩個對照管的相差來判定是否陽性，而不是以一個(至少我覺得)嚴苛得沒有道理的“反應跑完都沒有信號”這樣的標準來進行判斷。在這些火線建立的取樣點、樣品提取車間、檢測操作這一系列採集檢測程序中會出現什麼樣的狀況，又是使用一個極容易受到干擾的檢測手段來檢測，如何控制檢測質量和解讀數據的確需要功夫，但是設定為40我覺得就是檢測這個環節的“清零”思維。一點兒都不能有。

[以上僅僅是根據本人極有限的實驗實踐的粗鄙想法，尤其對公共衛生檢測中的管理、具體實驗室運作、實驗操作一無所知。只當是拋磚引玉。如有謬誤，望高人不吝賜教。]